Engelsmännen toppade gruppen på tolv poäng efter fyra spelade matcher, medan Tjeckien placerade sig på en andraplats med sina nio poäng efter fem spelade matcher.
Noterbart var att Chelseas talang Mason Mount fick chansen från start för första gången.
Det blev en rivstart på matchen, bara några minuter in i första halvlek tog vindsnabbe Raheem Sterling sig fram längs vänsterkanten. Engelsmannen föll efter en duell med Lukáš Masopust.
- Han är otroligt snabb och inte så kraftfull så det behövs inte så mycket för att han ska falla där, sa C Mores expertkommentator Alexander Axén.
Domaren pekade på straffpunkten och från elva meter var Harry Kane stensäker, 1-0 i femte minuten.
Strax därefter fick Evertons Jordan Pickford sträcka ut rejält då Vladimir Coufal drog iväg en kanon utanför straffområdet. Men Englands 25-årige målvakt lyckades rädda.
I nionde minuten kom dock repliken från Tjeckien på hörna då Jakub Brapec höll sig framme och kvitterade.
Efter den underhållande och fartfyllda inledningen minskade målchanserna och lagen gick till halvtidsvila i likaläge.
I andra halvlek var det Tjeckien som var närmast efter knappt timmen spelad då Masopust var nära att revanschera sig. Ett stenhårt skott men Pickford lyckades rädda återigen. Hetast framåt för England var Sterling som gång på gång försökte men stoppades av ett disciplinerat tjeckiskt försvar.
Ross Barkley hoppade in i 72:a minuten och var en stor bidragande orsak till att England kunde forcera fram chanser de sista 20 minuterna, hemmalaget såg allt mer trötta ut ju närmare 90 minuter klockan tickade.
Då klev Tjeckien fram genom Masopust igen. Han drev ner längs högerkanten och hittade Zdenek Ondrasek i straffområdet som sköt in 2-1 i 90:e minuten.
- England är obesegrade i 43 raka VM- eller EM-kvalmatcher, 34 segrar, nio oavgjorda. Tjeckien är på väg att göra något riktigt stort här, sa C Mores kommentator Patrik Westberg.
Resultatet stod sig också matchen ut vilket betyder att Tjeckien går upp på samma poäng som England men med en match mer spelad.
Se höjdpunkterna från matchen i spelaren högst upp i artikeln.
Startelvor:
Tjeckien: Vaclik - Coufal, Celustka, Brabec, Boril, Soucek, Kral, Masopust, Darida, Jankto, Schick
England: Pickford - Trippier, Rose, Rice, Keane, Maguire, Sterling, Henderson, Kane, Sancho, Mount